研究背景

免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)療法通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，重新激活患者體內(nèi)的免疫反應(yīng)來(lái)對(duì)抗癌癥。為了有效殺傷腫瘤，CD8 T 細(xì)胞可識(shí)別由人類白細(xì)胞抗原 I 類（HLA-I）分子呈遞的腫瘤特異性抗原肽。在人類中，有三個(gè)主要的 HLA-I 基因（HLA-A、HLA-B 和 HLA-C）。然而，ICB療法的響應(yīng)率并不一致，且存在治療抵抗性問(wèn)題。為了提高ICB療法的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和治療效果，研究人員開(kāi)始探索影響ICB反應(yīng)的多種因素，包括腫瘤免疫表型、體細(xì)胞基因組特征和腸道微生物組等。HLA-I基因型因其在調(diào)控免疫應(yīng)答中的核心地位而備受關(guān)注。來(lái)自紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的Timothy A. Chan團(tuán)隊(duì)提出了一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：HLA-I基因型是否會(huì)影響T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別能力，進(jìn)而影響患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療反應(yīng)? 為了回答這一關(guān)鍵問(wèn)題，Chan團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一項(xiàng)全面的研究。

研究方法

1. 樣本數(shù)據(jù)：本研究使用了接受ICB治療的兩組癌癥患者數(shù)據(jù)。隊(duì)列1包含369名接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的患者(269例晚期黑色素瘤，100例晚期非小細(xì)胞肺癌)的外顯子組測(cè)序和臨床數(shù)據(jù)；隊(duì)列2包含1166名來(lái)自紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的不同類型癌癥患者的靶向Panel測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。

2. HLA I類基因分型：本研究通過(guò)高準(zhǔn)確性工具Polysolver直接分析正常生殖細(xì)胞的外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)，或者使用經(jīng)過(guò)臨床驗(yàn)證的HLA分型檢測(cè)方法（如LabCorp的檢測(cè)服務(wù)）來(lái)執(zhí)行高分辨率的HLA I類基因分型。此外，對(duì)于隊(duì)列1，使用HLA-SOAP進(jìn)行了HLA II類基因分型。

3. 統(tǒng)計(jì)分析：使用Kaplan-Meier estimator進(jìn)行生存分析，采用log-rank檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯著性，使用單變量或多變量Cox回歸計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比?；谌怙@子測(cè)序的非同義突變總數(shù)計(jì)算腫瘤突變負(fù)荷，并使用R函數(shù)test設(shè)定截?cái)嘀担瑢⒒颊叻譃楦叩蛢山M。采用wilcoxon-秩和檢驗(yàn)比較HLA純合子組和雜合子組間的體細(xì)胞突變數(shù)以及治療中TCR CDR3克隆性。

4. 突變分析：對(duì)于隊(duì)列1，分析按DePristo等人描述的方法進(jìn)行。FASTQ格式的配對(duì)末端讀段使用Burrows-Wheeler比對(duì)器與參考人類基因組GRCh37進(jìn)行比對(duì)，利用GATK進(jìn)行局部重新比對(duì)，使用Picard去除重復(fù)讀段。使用整合了四種突變調(diào)用器的pipeline（MuTect、Strelka、SomaticSniper和Varscan）識(shí)別體細(xì)胞單核苷酸變異（SNVs）。等位基因讀數(shù)少于4或相應(yīng)正常覆蓋度少于7個(gè)讀段的SNVs被過(guò)濾掉。使用由三個(gè)調(diào)用器（Strelka、VarScan和Platypu）組成的pipeline識(shí)別小插入和缺失（indels）。對(duì)于隊(duì)列2，相對(duì)突變負(fù)荷使用MSK-IMPACT確定。

5. HLA I類基因雜合性喪失分析：使用FACETS進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析，以確定等位基因特異性拷貝數(shù)。識(shí)別包含HLA-A、HLA-B和HLA-C位點(diǎn)的染色體6p位點(diǎn)內(nèi)的片段。使用expectation-maximization model，將任何HLA位點(diǎn)的次要等位基因拷貝數(shù)估計(jì)為0定義為雜合性喪失（LOH）。

6. TCR β鏈測(cè)序和分析：研究對(duì)治療中（Nivolumab啟動(dòng)后4周）收集的腫瘤樣本子集進(jìn)行了測(cè)序（TCR-seq）。隨后計(jì)算了TCR CDR3譜系的clonality，定義為均勻度的補(bǔ)數(shù)（即1-均勻度）。均勻度定義為觀察到的Shannon熵（H）除以給定群體中唯一元素?cái)?shù)量的最大可能H（4）。從Adaptive Biotechnologies獲得了單個(gè)TCR序列的數(shù)據(jù)，包括V和J基因段識(shí)別和CDR3序列，用于T細(xì)胞譜系的自定義分析。對(duì)每個(gè)觀察到的VJ組合，單獨(dú)分析了由單個(gè)VJ盒組合編碼的CDR3氨基酸序列的克隆性。

7. HLA I類結(jié)構(gòu)分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬：使用VMD Mutator插件突變PDB 1M6O中pHLA復(fù)合物中的新抗原結(jié)構(gòu)，以符合所需的B44基序（F3I、P4G、A6V、F9Y）。所有圖像均使用VMD軟件包進(jìn)行渲染。分離的HLAI類等位基因和HLA肽復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬來(lái)自最高可用分辨率的晶體結(jié)構(gòu)：HLA-B*15:01（PDBID:1XR9)；HLA-B*07:02（PDBID:5EO0)；和HLA-B*53:01（PDBID:1A1M)；所有的MD模擬都使用NAMD軟件包進(jìn)行模擬。使用GROMACS 軟件套件中包含的標(biāo)準(zhǔn)工具計(jì)算殘差間分離和殘差位置均方根波動(dòng)（RMSFs）。

研究結(jié)果

1. HLA-I雜合性顯著提高ICB治療患者的生存率： 本研究通過(guò)對(duì)1535名接受ICB治療的癌癥患者的HLA-I基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與至少有一個(gè)HLA位點(diǎn)為純合子的患者相比，HLA-I位點(diǎn)的最大雜合度（“A”、“B”和“C”）提高了ICB治療后的總生存率（圖1A-C）。HLA-I純合性與低突變負(fù)荷強(qiáng)烈相關(guān)，與雜合性高突變負(fù)荷的患者相比，生存率降低（圖1D-G）。HLA-I基因的雜合性喪失（LOH）的患者生存率降低，且對(duì)腫瘤突變負(fù)荷低的患者生存率影響更大。此外，HLA雜合子患者表現(xiàn)出更高的TCR CDR3克隆性（圖3F，G）。

圖1.  HLA-I純合性對(duì)ICB治療患者生存率的影響。(A，B) 隊(duì)列1/2中至少一個(gè)HLA-I位點(diǎn)的純合性與OS降低相關(guān)；(C)所有1535例患者的HLA-I純合性與OS降低相關(guān)；(D，E)在兩個(gè)隊(duì)列中分別比較了具有雜合HLA-I位點(diǎn)且高突變負(fù)荷的患者與具有純合HLA-I位點(diǎn)且低突變負(fù)荷的患者的生存率，發(fā)現(xiàn)雜合性且高突變負(fù)荷的患者生存率更好；(F，G)HLA-I雜合性和突變負(fù)荷對(duì)生存率的聯(lián)合影響比單獨(dú)的突變負(fù)荷更大；(H)HLA-I的LOH與ICB治療患者的OS降低相關(guān)；(I)低突變負(fù)荷腫瘤中的LOH相對(duì)高突變負(fù)荷和無(wú)LOH腫瘤對(duì)預(yù)后影響更大。

2. HLA-B44超型對(duì)總生存率的影響：在兩個(gè)獨(dú)立的黑色素瘤隊(duì)列中，將HLA-I等位基因分類為12個(gè)不同的超型（圖2A，B）， 發(fā)現(xiàn)HLA-B44超型患者對(duì)延長(zhǎng)生存期效果顯著（圖2C，D），尤其是在考慮體細(xì)胞突變負(fù)荷時(shí)（圖2E-H）。

圖2.  HLA-B44超型對(duì)ICB治療的黑色素瘤患者生存的影響。(A，B)隊(duì)列1/2中黑色素瘤患者中不同HLA超型的患病率；(C，D)對(duì)隊(duì)列1/2中攜帶B44等位基因（B44(+)）與不攜帶B44等位基因（B44(-)）的患者的生存情況；(E，F(xiàn))對(duì)隊(duì)列1/2中攜帶B44等位基因且具有高突變負(fù)荷的患者與不攜帶B44等位基因且具有低突變負(fù)荷的患者的生存情況；(G，H)B44等位基因和突變負(fù)荷對(duì)生存率的聯(lián)合影響比單獨(dú)考慮突變負(fù)荷更大；(I)TCGA隊(duì)列中B44等位基因與生存率無(wú)顯著關(guān)聯(lián)；(J)B44等位基因中常見(jiàn)的肽基序與已知的免疫原性新抗原相關(guān)聯(lián)。

3. HLA-B62超型與不良預(yù)后相關(guān)：B62超型與生存率的負(fù)相關(guān)性主要由HLA-B*15:01等位基因驅(qū)動(dòng)（圖3A）。通過(guò)三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其在肽結(jié)合槽中具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)橋（圖3B，C）。分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬顯示，與其他HLA-B等位基因相比，HLA-B*15:01在結(jié)合肽段時(shí)保持了結(jié)構(gòu)橋的完整性，并且橋接殘基變得更不靈活，這可能影響T細(xì)胞受體對(duì)新表位的有效識(shí)別（圖3D，E）。

圖3.  HLA-B*15:01等位基因?qū)CB治療患者生存率的影響。(A) HLA-B*15:01等位基因的患者生存率降低；(B) HLA-B*15:01、結(jié)合肽和橋接殘基的肽結(jié)合槽三維結(jié)構(gòu)；(C) 在結(jié)合肽殘基位置P2和P3上的橋接隔離效應(yīng)的側(cè)視圖；(D、E) 分離的HLA B*15:01分子及其與UBCH6肽的復(fù)合物的MD模擬快照，肽存在時(shí)橋接殘基的RMSFs增加；(F、G)治療期間，HLA雜合患者的TCR CDR3克隆性更高。

結(jié)論

通過(guò)對(duì)1535名接受ICB治療的癌癥患者的HLA-I基因型分析，HLA-I位點(diǎn)雜合性提高了ICB后的總生存期，且HLA-B44超型患者生存期延長(zhǎng)，而 HLA-B62超型（包括HLA-B*15:01）或HLA-I時(shí)體細(xì)胞雜合性缺失與不良預(yù)后相關(guān)。HLA-B*15:01的分子動(dòng)力學(xué)模擬揭示了可能損害CD8 T細(xì)胞對(duì)新抗原識(shí)別的不同元素。本研究結(jié)果對(duì)于預(yù)測(cè)對(duì)ICB的反應(yīng)和基于新抗原的治療性疫苗的設(shè)計(jì)具有重要意義?？偟膩?lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究為理解HLA-I基因型在癌癥免疫治療中的作用提供了新的視角，并為未來(lái)的癌癥治療策略提供了重要的指導(dǎo)。隨著免疫治療的不斷發(fā)展，深入理解這些遺傳因素如何影響治療效果，將有助于實(shí)現(xiàn)更個(gè)性化、更有效的癌癥治療。

參考文獻(xiàn)

Diego Chowell et al. ,Patient HLA class I genotype influences cancer response to checkpoint blockade immunotherapy. Science359,582-587(2018).DOI:10.1126/ science.aao4572

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